绫波零是EVA零号机的专属驾驶员。她在真嗣调来第三新东京市的三周前的零号机启动实验中，因事故受伤。在学校，她无口无心无表情的性格使得没有人与她交往。但真嗣却见到她微笑着与自己父亲源度交谈，于是对零产生了兴趣。 第五使徒袭来，刚被发射出的初号机就遭到了高热加粒子炮的攻击……

第五适任者——渚薰出现在沮丧的真嗣面前，但真嗣总觉得他给人的感觉和凌波零是一样的。使徒来袭，这次的使徒竟然对明日香进行精神攻击！虽然零使用“朗基努斯之枪”消灭了使徒，但明日香的心灵已经崩溃……

EVA三号机的测试驾驶员——第四适任者决定由真嗣的朋友铃原冬二来担任，而条件是治疗他妹妹的病。但是，在启动试验开始时却出现了状况，真嗣他们被命令紧急出动，然而攻击的目标竟然是冬二的三号机！

明日香驾驶的二号机和真嗣驾驶的初号机拼死对抗Seele和EVA系列。就在这时，此前飞出外太空的“朗基努斯之枪”正从月球高速返回地球，并停在了真嗣的初号机胸前，形成了伟大的“生命之树”形态。另一方面，碇源堂因为体内的“亚当”苏醒，一心想与拥有“莉莉丝”意识的零融合，完成自己成为“神”的夙愿，但却遭到零的拒绝。最终，零走向“莉莉丝”的躯体，并完成融合，使完全形态的“莉莉丝”最终苏醒。“莉莉丝”与“生命之树”相互吸引，人类即将迎来第三次冲击。

新的使徒来袭，真嗣和明日香奉命出击，却因为默契太差而被打得落花流水。为此，美里提出了一套作战方式，要求两人必须住在同一所房子里，从而培养出绝佳的默契。通过培训，真嗣看到了明日香的另一面，也改变了对她的看法！

面对冷漠的父子态度，美里提出要与真嗣同住的要求，并且对真嗣作战的成绩表示赞赏，但真嗣希望这话是出自另一人之口……在没有受过特殊训练的情况下，真嗣与EVA 达成同步并和使徒作战。因为真嗣不熟悉操作，也无实战经验，在遭到使徒的攻击后，为保护同学，冒险作出了一个决定……